ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因分析
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是一種常用的固相酶免疫測(cè)定方法。Engvall 和Perlmann于1971年zui先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測(cè)定，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）"。 ELISA的基本原理是：
①使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；
②使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原（或抗體），而且此酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；
③測(cè)定時(shí)將受檢標(biāo)本（抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開(kāi)，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例；再加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)其顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析，以了解被測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原含量。 
ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在研究檢驗(yàn)中除正常反應(yīng)外，有時(shí)?？梢?jiàn)到一些錯(cuò)誤結(jié)果（即假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果）。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：
①標(biāo)本因素；
②試劑因素；
③操作因素。
本文就標(biāo)本因素對(duì)ELISA測(cè)定的影響做如下討論。 
血清是zui常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：
1． 內(nèi)源性物質(zhì) 有人認(rèn)為大約40%的科研血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig （s）抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。 
（1）類(lèi)風(fēng)濕因子 
科研血清中IgM、IgG型類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。
解決該情況的辦法是：
①用F（ab）2替代完整的IgG；
②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；③檢測(cè)抗原時(shí)，可以用等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。 
（2）補(bǔ)體 ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，使C1q 可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。 
（3）嗜異性抗體 人類(lèi)血清中含有能與嚙齒類(lèi)動(dòng)物（如鼠等）Ig （s） 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái)，也能造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng)物Ig （s） ，但加入量不足或亞類(lèi)不同時(shí)無(wú)效。 
（4）嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定。 
（5）醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig （s） 抗體 研究開(kāi)展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些樣本體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物咬傷的樣本體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig （s） 抗體。這些樣本ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig （s） ，從而克服由于上述原因造成的假陽(yáng)性。 
（6）交叉反應(yīng)物質(zhì) 類(lèi)地高辛、類(lèi)AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí)，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。 
（7）標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等，均對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有干擾作用。 
2． 外源性物質(zhì) 
外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過(guò)久、標(biāo)本凝集不全和采血管中添加物等影響。 
（1）標(biāo)本溶血 由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測(cè)定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時(shí)必須注意避免溶血。 
（2）標(biāo)本受細(xì)菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。 
（3）標(biāo)本保存不當(dāng) 在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、甚至造成假陽(yáng)性；標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（如一天以上），有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。 
（4）標(biāo)本凝集不全 在沒(méi)有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開(kāi)始凝固，18~24h*凝固。研究檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；這類(lèi)情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已*，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用，解決的辦法是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?nbsp;
（5）標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有一定干擾作用。 綜上所述，對(duì)研究檢驗(yàn)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析，并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除干擾作用，從而為研究提供正確可靠的檢測(cè)結(jié)果。

酶聯(lián)免疫（ELISA）使用試劑盒檢測(cè)過(guò)程中值得關(guān)注的問(wèn)題
1、儀器質(zhì)控
 為使儀器保持工作狀態(tài)，應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍）、溫箱、洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。
◎移液器： ELISA加樣量?。?0-200μl），其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：低、中、高三個(gè)刻度分別吸取指示量的水，萬(wàn)分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±5%以內(nèi)；
◎恒溫箱： 經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí)測(cè)溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；
◎洗板機(jī)： 每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定，一般不超過(guò)2μl；人工扣板時(shí)，墊紙不濕；定期檢查管孔是否堵塞；
◎酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測(cè)校正，使其保持良好的工作性能。
2、試劑盒選擇
◎應(yīng)盡量選擇正規(guī)廠家，產(chǎn)品經(jīng)相應(yīng)政府部門(mén)審核認(rèn)可，試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡(jiǎn)便性、安全性及經(jīng)濟(jì)性全面評(píng)價(jià)。
◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的zui低量的能力；2）為試劑對(duì)大量樣品中陽(yáng)性檢出的能力。
◎特異性：常用交叉反應(yīng)率表示。含有與待測(cè)物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)，使測(cè)定結(jié)果升高，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以交叉反應(yīng)是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。
◎精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV%，其值應(yīng)小于15%；定量試劑應(yīng)同時(shí)考察線性范圍。
◎準(zhǔn)確度：通過(guò)添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
◎簡(jiǎn)便性：指在不影響試劑的前三項(xiàng)指標(biāo)的前題下，實(shí)驗(yàn)和測(cè)定步驟越少越好，在定性實(shí)驗(yàn)中結(jié)果判斷簡(jiǎn)單明了，定量試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算也應(yīng)簡(jiǎn)單。
◎安全性：指試劑對(duì)操作者和環(huán)境安全無(wú)害無(wú)傳染性。
◎經(jīng)濟(jì)性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過(guò)大規(guī)模生物試劑或技術(shù)進(jìn)步降低成本，而市場(chǎng)價(jià)格比較合理。
◎試劑評(píng)價(jià)：需要有的確證方法和確證的樣品進(jìn)行檢測(cè)。
3、樣本前處理注意事項(xiàng)
3.1 均質(zhì)
組織樣本:肉、肝食品類(lèi)切細(xì)，用絞肉機(jī)反復(fù)絞碎，混合均勻。
水產(chǎn)樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細(xì)，用均質(zhì)器均漿；原料表面較臟時(shí),需適當(dāng)用蒸餾水清洗。
蛋類(lèi)：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。
水果、蔬菜類(lèi)：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振蕩提取
 將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織內(nèi)部，提取待測(cè)組分。
3.2.1振蕩方式：振蕩器上進(jìn)行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。
3.2.2 在組織樣本中加入有機(jī)溶劑之間提取時(shí)，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團(tuán)，不利于提取。
3.3. 在用有機(jī)溶劑提取過(guò)程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：①用細(xì)頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復(fù)離心。②再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。
3.4 濃縮
 由于凈化過(guò)程中引入的溶劑，可能會(huì)降低待測(cè)組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機(jī)溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮?dú)庀麓蹈?，再用?fù)溶液溶解干燥殘留物。
濃縮方式：
 氮?dú)獯蹈沙s、壓縮空氣吹干除雜。
注意：
3.4.1在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。
3.4.2在吹樣本時(shí)，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。
3.4.3樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響zui終檢測(cè)結(jié)果。
3.4.4不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。
3.5 凈化
 經(jīng)過(guò)提取的待測(cè)組分中通常含有一些會(huì)干擾試劑盒中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測(cè)物結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)。將待測(cè)組分與雜質(zhì)分離的過(guò)程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的zui常見(jiàn)的凈化是：液液分配法。
 比如：用復(fù)溶液溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復(fù)溶液渦動(dòng)后如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可以60℃水浴加熱，至乳化現(xiàn)象消失或減弱后，加大離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心。
 實(shí)例：
 A、氟喹諾酮類(lèi)藥物試劑盒現(xiàn)有的水產(chǎn)樣本前處理方法中，用二氯甲烷作為提取劑。
注意：
 （a）二氯甲烷的密度比水大，離心完后，二氯甲烷在下層，須先用加樣器吸盡上層廢液后，再按要求取適量的下層吹干。
 （b）在用加樣器吸取下層的有機(jī)相時(shí)，正常操作往往取量不準(zhǔn)確，此時(shí)用帶有刻度，且刻度較準(zhǔn)確的玻璃管來(lái)定量。
 （c）上訴情況對(duì)有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)員還可以通過(guò)靈活控制加樣器來(lái)控制取樣的準(zhǔn)確性。
 （d）在振蕩過(guò)程中要注意安全。二氯甲烷在振蕩的過(guò)程中，如果離心管密封性不是很好，往往容易爆開(kāi)；在進(jìn)行振蕩時(shí)，不要讓離心管口對(duì)準(zhǔn)自己或者其他人，避免濺到自己或者他人身上。
 （e）試劑盒在使用前充分回溫很必要，如回溫不充分該項(xiàng)目曲線受影響較明顯。
    B、硝基呋喃代謝物檢測(cè)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題
    硝基呋喃代謝物有四種：3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）和1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）在檢測(cè)過(guò)程中也需要同其它項(xiàng)目一樣進(jìn)行添加回收測(cè)評(píng)，其中需要注意以下幾個(gè)問(wèn)題。
    代謝物在組織中是與蛋白呈結(jié)合狀態(tài)，采用普通的有機(jī)溶劑或緩沖液，是無(wú)法提取該代謝物的。需要用鹽酸水解后才能使呋喃類(lèi)代謝物游離，所以在加入去離子水、鹽酸和2-硝基苯甲醛（2-NBA）混合均勻后，其pH應(yīng)在1-3之間，否則不利用水解代謝物。
在衍生化過(guò)程中，溫度和時(shí)間決定其衍生化產(chǎn)率，衍生化后在加入氫氧化鈉和磷酸氫二鉀時(shí)，其pH應(yīng)在中性左右。由于部分樣本的緩沖能力不同，所以需對(duì)其pH進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)樵谒嵝曰驂A性環(huán)境中，不利于呋喃類(lèi)代謝物的提取回收，同時(shí)也容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
    添加回收的幾種誤區(qū)：
    呋喃類(lèi)代謝物提取過(guò)程通常分三個(gè)關(guān)鍵步驟：
 水解-----衍生化-----提取
 （1）采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的zui大標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行添加回收。如德國(guó)拜發(fā)和我公司AOZ試劑盒中的第6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)8.1ppb。因?yàn)檫@些標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)過(guò)衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品，不能代表樣本前處理實(shí)驗(yàn)中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個(gè)步驟，所以就算回收率很高，但失去了實(shí)際參考價(jià)值。
 （2）*依賴未衍生的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收。因部分未衍生的代謝物在配制成標(biāo)準(zhǔn)品后有一定的有效期，會(huì)存在潛在的不穩(wěn)定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，不能驗(yàn)證從組織蛋白中水解呋喃類(lèi)代謝物的過(guò)程，因此也有一定的局限性。
 的評(píng)價(jià)方案：采用經(jīng)LC-MS-MS確證的陰陽(yáng)性樣品，留作質(zhì)控樣品，對(duì)檢測(cè)的樣本和試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。這也是實(shí)驗(yàn)室所出數(shù)據(jù)可信度說(shuō)服力的關(guān)鍵點(diǎn)。
4、 酶標(biāo)分析過(guò)程中的注意事項(xiàng)
     樣本的檢測(cè)是基于抗原抗體的反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定樣本zui終的藥物含量。它要求加樣的準(zhǔn)確性和洗板的一致性。在整個(gè)加樣的過(guò)程中注意實(shí)驗(yàn)室溫度的恒定，保證反應(yīng)在試劑盒所示的溫度下進(jìn)行。
4.1常見(jiàn)加樣方式
A、吸一打二
B、吸二打一
 在實(shí)際操作過(guò)程中，提倡用“吸二打一"用這種方式，有如下幾個(gè)好處：
 a、加樣過(guò)程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡
 b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時(shí)間差。
在加樣的過(guò)程中還應(yīng)細(xì)心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：
A、加樣的過(guò)程中漏加或者重加；
B、加樣的過(guò)程中忘記更換吸頭；
C、樣本的重加或者漏加；
D、忘記記錄樣本的加樣順序。
4.2常見(jiàn)的洗板方式
A、洗板機(jī)洗板；
B、多道孔加樣器洗板；
C、多孔吸頭洗板；
   在洗板的過(guò)程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說(shuō)明書(shū)操作，不可過(guò)多，避免溢出板孔，污染其它樣本；過(guò)少，則達(dá)不到洗滌的效果，容易出現(xiàn)曲線不成線性，花板等情況。
4.3 甩板
 快速甩盡板孔內(nèi)的液體，防止板孔里的液體對(duì)流或反濺回板孔中產(chǎn)生交叉污染。
4.4拍板
 輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體，而且吸水紙只能使用一次。
4.5 顯色
 值得注意的是，并非試劑盒中所規(guī)定的顯色時(shí)間是的，因?yàn)樵噭┖械奈舛戎禃?huì)受環(huán)境中的溫度、濕度、酶標(biāo)板反應(yīng)時(shí)所接觸到的物品的導(dǎo)熱度等有關(guān)，實(shí)驗(yàn)操作人員在加完顯色液后，可根據(jù)顏色的深淺適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)或者縮短顯色時(shí)間。防止出現(xiàn)吸光值接近或高于酶標(biāo)儀的zui高檢測(cè)靈敏度（OD值在2.5-3.0之間），這樣會(huì)間接影響到檢測(cè)結(jié)果，如出現(xiàn)曲線前半部份梯度不明顯或顛倒數(shù)值等現(xiàn)象，也就造成了一些假陽(yáng)性或部分檢測(cè)結(jié)果偏低的現(xiàn)象。

ELISA技術(shù)要點(diǎn)和常見(jiàn)問(wèn)題
在ELISA實(shí)驗(yàn)前的注意事項(xiàng) 
仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)確定試劑盒在有效期內(nèi)按說(shuō)明書(shū)確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）標(biāo)本制備要規(guī)范，每份標(biāo)本體積要按2-3個(gè)復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無(wú)法實(shí)驗(yàn)者，注意低溫保存準(zhǔn)備好所有實(shí)驗(yàn)額外所需物品，如試管、吸頭、移液器、離心機(jī)等根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量按說(shuō)明書(shū)將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑
DIY夾心法ELISA常見(jiàn)技術(shù)指南 
選擇抗體時(shí)選擇一個(gè)單抗和一個(gè)多抗進(jìn)行配對(duì)；若選擇兩個(gè)單抗，必須識(shí)別不同表位的抗體；從同一家公司選擇抗體對(duì)。ELISA實(shí)驗(yàn)中為了確定佳信號(hào)和zui低背景應(yīng)將捕獲抗體（0.5-4μg/ml）和檢測(cè)抗體（0.25-2μg/ml）在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行彼此相抗的滴定。同時(shí)，應(yīng)包括在適當(dāng)范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋。按試劑說(shuō)明書(shū)常規(guī)提供的范圍進(jìn)行操作。標(biāo)準(zhǔn)品的配制：對(duì)于每種細(xì)胞因子應(yīng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，注意每批的細(xì)節(jié)。在使用細(xì)胞因子前，瞬時(shí)離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細(xì)胞因子。根據(jù)每批說(shuō)明書(shū)中的細(xì)節(jié)，將凍干的細(xì)胞因子復(fù)溶。一般待測(cè)抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍的可通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml?？衫脴?biāo)準(zhǔn)的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類(lèi)試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內(nèi)提高靈敏度。為了優(yōu)化靈敏度，建議過(guò)一晚孵育標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本。若使用過(guò)氧化物酶作為顯色系統(tǒng)，應(yīng)嚴(yán)禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過(guò)氧化物酶的活性。當(dāng)測(cè)定混合液體中的抗原時(shí)，如血清，建議在標(biāo)本稀釋液中加不相干的Ig.
ELISA常見(jiàn)問(wèn)題及處理對(duì)策 
問(wèn)題 
可能原因 
解決方法 
無(wú)顏色
試劑孵育的時(shí)間沒(méi)有按說(shuō)明書(shū)操作。確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時(shí)間是否適當(dāng)。
不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑混用。重新檢查試劑的標(biāo)簽，確準(zhǔn)所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑。
漏加酶檢查操作流程，注意不要漏加
HRP酶污染了疊氮鈉使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉
標(biāo)準(zhǔn)品有問(wèn)題（若在標(biāo)本孔中有信號(hào)）按說(shuō)明書(shū)檢查標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用1瓶新標(biāo)準(zhǔn)品
某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì)盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠
使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體重新確認(rèn)所選用的試劑
.漏加顯色劑A或B加顯色劑后觀察一下液面高度
試劑配制/使用有誤將實(shí)驗(yàn)重做；嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，每次配制和使用前看清標(biāo)簽。
緩沖液污染配制新新鮮的緩沖液
顯色弱
超過(guò)有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號(hào)。檢查產(chǎn)品的有效期
加入試劑的體積和時(shí)間有誤確定所使用的每一個(gè)試劑的體積正確的和加入的時(shí)間是適當(dāng)?shù)摹?br>試劑、樣品用前未能平衡用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右
縮短孵育時(shí)間能使實(shí)驗(yàn)的信號(hào)變?nèi)?。檢查孵育的時(shí)間。
在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。確定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。
使用了被污染的試劑檢查試劑是否被污染。
標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本制備方法不規(guī)范檢查標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的標(biāo)本避免反復(fù)凍融，嚴(yán)禁使用溶血標(biāo)本。樣品用NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng)
顯色底物制備不規(guī)范檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當(dāng)充分。
檢測(cè)時(shí)間不當(dāng)是否在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)。
儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。
高背景（本底）
洗滌操作不規(guī)范洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。使用洗板機(jī)，或使用洗瓶洗滌。每孔應(yīng)*充滿洗滌緩沖液，傾出時(shí)應(yīng)迅速。若使用洗板機(jī)，應(yīng)校準(zhǔn)并設(shè)定足夠充滿每孔的體積量。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準(zhǔn)確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。
實(shí)驗(yàn)中孵育溫度和時(shí)間不適當(dāng)確定每一實(shí)驗(yàn)步驟的孵育溫度和時(shí)間是否適當(dāng)
酶加量過(guò)多加酶前驗(yàn)看移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確。檢查稀釋度，若必要進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。
封閉不*檢查封閉液的計(jì)算量；提高封閉時(shí)間。
標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì)做適當(dāng)?shù)膶?duì)照
顯色劑受光照時(shí)間較長(zhǎng),或污染顯色劑A和B應(yīng)于使用*分鐘從冰箱取出
整批樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng),樣品污染樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染
緩沖液污染制備新鮮的緩沖液
吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不*而用于加酶或顯色劑吸頭盡可能一次性使用
太多的信號(hào)：全部的板子變成規(guī)則的藍(lán)色不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒(méi)結(jié)合的過(guò)氧化物酶仍有殘留。使用洗板機(jī)充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準(zhǔn)確。
底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍(lán)色應(yīng)控制底物混合的時(shí)機(jī)并立即使用
太多的酶結(jié)合物檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定
封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍(lán)色。使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器
緩沖液中污染金屬或HRP制備新鮮緩沖液
高CV值（CV：coefficient of variation），花板
操作不慎或洗滌不充分按說(shuō)明書(shū)洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述
出現(xiàn)干板，沒(méi)有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用確定每?jī)刹襟E間，酶標(biāo)板應(yīng)保持濕潤(rùn)。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。
由于操作失誤或板子質(zhì)量差（結(jié)合不均勻）造成包板不均勻。稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時(shí)間和試劑加入的方法。檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）
移液器不準(zhǔn)確，吸頭重復(fù)使用。檢查并校準(zhǔn)移液器。每次取樣必須換吸頭?；仡櫂?biāo)本的加入步驟，確保每次加樣的準(zhǔn)確性，保證吸取的液體按所設(shè)定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時(shí)注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。
樣品離心處理不全,反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分標(biāo)本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴(yán)禁使用凝血（溶血）的標(biāo)本
緩沖液污染制備新鮮的緩沖液
標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到，但兩點(diǎn)之間區(qū)別很差（低或平的曲線）
酶結(jié)合物不足檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定
捕獲抗體沒(méi)有很好結(jié)合到板上檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白
檢測(cè)抗體不足檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定
板子顯色不足延長(zhǎng)底物孵育實(shí)驗(yàn)使用推薦品牌的底物溶液
操作不慎回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。
標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋度計(jì)算有誤核查計(jì)算的情況，制備新的標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是沒(méi)有任何期望的陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生在標(biāo)本中無(wú)相應(yīng)的細(xì)胞因子使用內(nèi)參對(duì)照重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重新考慮實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)參數(shù)
標(biāo)本基質(zhì)遮蓋檢測(cè)將標(biāo)本至少做1∶2相應(yīng)的稀釋，或進(jìn)行系列稀釋觀測(cè)它的恢復(fù)性
標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是標(biāo)本的判讀值很高標(biāo)本中含的細(xì)胞因子水平超過(guò)實(shí)驗(yàn)范圍將標(biāo)本做稀釋并再次實(shí)驗(yàn)
當(dāng)使用HRP酶結(jié)合物時(shí)，TMB底物加終止液后顯綠色孔中的試劑顯色不充分輕輕振蕩板子
邊緣效應(yīng)
工作環(huán)境溫度不均衡避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育
漂移
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)間斷整個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)連續(xù)操作：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將所有標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本做適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備
試劑沒(méi)有按說(shuō)明書(shū)平衡至室溫在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說(shuō)明書(shū)中有另外的要求。
是否可更改試劑盒  所提供的實(shí)驗(yàn)操作步驟？
一般廠商為確保zui高的靈敏度和特異性，對(duì)試劑盒都進(jìn)行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性應(yīng)按說(shuō)明書(shū)操作。
是否可混用不同試劑盒中的試劑？
不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問(wèn)題可與廠家或代理商。
是否可增加或減少標(biāo)本的體積。
商品化的試劑盒所需加入的標(biāo)本體積是優(yōu)化的，應(yīng)按說(shuō)明書(shū)操作，不建議更改所加標(biāo)本的體積。
是否可重確定自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)？
可以。說(shuō)明書(shū)上有建議的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線的點(diǎn)，但是必須在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，高于試劑盒中zui高標(biāo)準(zhǔn)品的點(diǎn)和低于靈敏度以下的點(diǎn)是無(wú)效的。