本試劑盒采用JC-1一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時(shí)以單體的形式存在，高濃度時(shí)以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，但均可在流式細(xì)胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，JC-1可透過正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△y）具有極性，JC-1依賴于△y的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光；可被流式細(xì)胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。本試劑盒可應(yīng)用于細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測。

操作步驟(僅供參考)：

1、 配制JC-1染色工作液：

取適量JC-1 Stain (200×)，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀釋JC-1，劇烈Vortex充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×)，混勻后即為JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1ml，其它培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推。

2、 設(shè)置陽性對照：

推薦CCCP(10mM)加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中處理細(xì)胞。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。

3、對于懸浮細(xì)胞：

a. 取1～6×105細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

b. 加入0.5ml JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。

c. 在孵育期間，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

d. 37℃孵育結(jié)束后， 4℃ 600g離心3～4min，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

f. 再用JC-1 Buffer(1×)重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測或流式細(xì)胞儀分析。

4、對于貼壁細(xì)胞：

注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

a.吸除6孔板培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

b. 加入1ml JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。

c. 在孵育期間，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

d. 37℃孵育結(jié)束后， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次。

e. 加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

f. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對于純化的線粒體：

a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀釋5倍。

b. 0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。

c. 用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描，激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm時(shí)，可以在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。

d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6、熒光觀測和結(jié)果分析：

檢測JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)注意事項(xiàng)
1，JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2，請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。

3，如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。 JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

4，應(yīng)避免反復(fù)凍融。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否則導(dǎo)致JC-1很難充分溶解，嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用.

5，裝載完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗滌時(shí)，盡量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。

6，CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。

 7，為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。