ELISA試劑盒基本原理介紹（初級）

實驗原理

    用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準(zhǔn)確地定量。

     辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素（protonhemin）區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的zui大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的zui大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP純度（RZ）=A403nm/A275nm純度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，zui高可達(dá)3.4。用于ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三條：

    （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；
    （2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；
    （3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。

    ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于研究標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個方面： 1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

基本方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過一夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

基本方法二　用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過一夜。次日洗滌3次。
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加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）
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于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。
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其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

（二）酶與底物

    酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。

免疫技術(shù)常用的酶及其底物 

ELISA試劑盒基本原理介紹（初級）