MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物

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明膠酶譜法試劑盒檢測步驟：

1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因?yàn)槿煞謴?fù)雜,MMP活性較低，的方法是將全血中白細(xì)胞進(jìn)行分離做陽性對照

3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí)。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時(shí)間為10小時(shí)或過夜。

6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

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MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物

使用上海信帆生物明膠酶譜法試劑盒發(fā)表的文章：

《綠茶多酚EGCG增強(qiáng)動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及其相關(guān)機(jī)制研究》

*部分綠茶多酚EGCG增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目的:急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一系列研究嚴(yán)重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不穩(wěn)定型心絞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究資料已證實(shí),急性冠脈綜合征發(fā)病的zui主要病理生理基礎(chǔ)是冠狀動脈中不穩(wěn)定型動脈粥樣硬化斑塊的破裂,引起冠狀動脈內(nèi)急性血栓形成,繼而引起心肌嚴(yán)重的缺血、缺氧。近年來,多項(xiàng)研究流行病學(xué)研究報(bào)道稱,飲用綠茶可以明顯降低冠心病的發(fā)病率。綠茶的抗動脈粥樣硬化作用主要原因是綠茶中含有大量的多酚類化合物,其中含量zui多的為兒茶素。綠茶中兒茶素主要成分包括表兒茶素(EC),表兒茶素沒食子酸酯(ECG),表沒食子兒茶素(EGC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。在這些成分中,以EGCG含量zui豐富,活性zui強(qiáng),已被證明具有多種藥理學(xué)作用和生物學(xué)特性。我們進(jìn)行本研究主要目的就是為了證實(shí)綠茶多酚EGCG是否能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性并探討其可能的相關(guān)機(jī)制。

方法:30只雄性ApoE缺陷小鼠(6周齡,體重18-20g)被隨機(jī)分為對照組(n=15)以及EGCG組(n=15)這些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%膽固醇的高脂飲食喂養(yǎng)。EGCG組以及對照組分別給予EGCG(10mg/kg)或者同等劑量的0.9%生理鹽水進(jìn)行腹腔注射共16周。隨后麻醉處死小鼠,取小鼠頭臂干動脈并予固定石蠟包埋。小鼠頭臂干橫切面進(jìn)行HE染色以及Masson染色分別評估動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)以及膠原含量。此外,使用免疫組織化學(xué)染色的方法分析小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞成分的比例。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)用來檢測斑塊中蛋白表達(dá)水平,明膠酶譜法用來檢測斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。

zui后,我們用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測小鼠血清炎癥因子單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及干擾素-γ(IFN-γ)水平。結(jié)果:高脂飲食喂養(yǎng)16周后,ApoE缺陷小鼠頭臂干動脈近端橫切面HE染色可見明顯的動脈粥樣硬化斑塊形成,提示造模成功。另外,與對照組相比,EGCG組ApoE缺陷頭臂干動脈近端粥樣硬化病變程度明顯減輕。Masson染色結(jié)果提示,EGCG干預(yù)后動脈粥樣硬化斑塊中膠原成分明顯增加。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)EGCG組斑塊中巨噬細(xì)胞比例明顯降低,而斑塊中平滑肌成分顯著增高。此外,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)EGCG可以顯著降低ApoE缺陷小鼠斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)的表達(dá)。同樣,明膠酶譜法結(jié)果提示EGCG組斑塊中MMP-2和-9活性較對照組明顯減低。

zui后,與對照組相比,EGCG腹腔注射后,ApoE缺陷小鼠血清炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α以及IFN-γ水平顯著降低。結(jié)論:本研究結(jié)果提示,綠茶多酚EGCG能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。此外,EGCG增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性的內(nèi)在機(jī)制可能與其抑制多種炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子以及機(jī)制金屬蛋白酶表達(dá)有關(guān)。第二部分EGCG通過與67LR相互作用抑制巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)目的:大量研究資料表明在不穩(wěn)定型動脈粥樣硬化破裂過程中,由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)以及基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中zui主要的多酚類化合物,資料顯示EGCG具有多種藥理學(xué)活性并且能夠?qū)π难馨l(fā)揮保護(hù)性作用。

近年來,實(shí)驗(yàn)已證實(shí)相對分子量為67000的層粘連蛋白受體(67LR)為EGCG主要膜表面受體,EGCG與67LR相互作用后可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究的主要目的就是為了評估EGCG是否能夠抑制佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞 EMMPRIN 以及 MMP-9 的表達(dá),并且探討其可能的相關(guān)機(jī)制。方法:使用不同濃度的EGCG預(yù)處理人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞1小時(shí)后,以佛波酯(PMA,100nmol/L)誘導(dǎo)48小時(shí)使其分化為巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中使用小干擾RNA(Small-interfering RNA,siRNA)沉默EMMPRIN基因表達(dá)。實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-Time PCR)測定 EMMPRIN 和 MMP-9 mRNA 表達(dá),蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測EMMPRIN以及MMP-9蛋白表達(dá),使用明膠酶譜法檢測MMP-9的活性。

結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)EGCG(10-50μmol/L)可以明顯抑制巨噬細(xì)胞EMMPRIN以及MMP-9的表達(dá),抑制作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,隨著EGCG濃度的增加,其抑制作用明顯增強(qiáng)。Extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)、p38 以及c-Jun N-terminal kinase(JNK)信號通路與EMMPRIN和MMP-9的表達(dá)密切相關(guān),EGCG同樣能夠顯著抑制ERK1/2、p38以及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。

使用基因沉默的方法下調(diào)巨噬細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)可以使MMP-9的表達(dá)以及活性明顯下降,提示在EGCG主要通過抑制巨噬細(xì)胞EMMPRIN合成進(jìn)而抑制MMP-9的表達(dá)。為了進(jìn)一步證明EGCG是否通過67LR相互作用發(fā)揮其抑制EMMPRIN以及MMP-9表達(dá)的作用,我們使用67LR抗體封閉巨噬細(xì)胞表面67LR以阻斷EGCG與67LR的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG對巨噬細(xì)胞EMMPRIN以及MMP-9表達(dá)的抑制作用明顯減弱,同樣67LR抗體阻斷了 EGCG對于ERK1/2、p38以及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用。

結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明,EGCG可以通過抑制ERK1/2、p38以及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活進(jìn)而降低巨噬細(xì)胞EMMPRIN和MMP-9表達(dá),這些生物學(xué)效應(yīng)是通過EGCG與67LR相互作用介導(dǎo)的。另外,研究發(fā)現(xiàn)在EGCG抑制MMP-9表達(dá)的過程中,EMMPRIN發(fā)揮著主要作用。以上研究結(jié)果提示綠茶多酚EGCG可能成為一種穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的治療劑。

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